实用细胞凋亡总结 细胞凋亡分析5篇

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细胞凋亡总结 细胞凋亡分析篇1

关键词细胞凋亡；中毒

中文图书号d919．

4文献标识码b

文章编号1007—9297(2007)03—0232—0

3自1972年由kerr等提出细胞凋-l~?(apoptosis)的概念后。人们对细胞凋亡现象进行了广泛深入研究。

随着医学分子生物学的不断发展，细胞凋亡

已成为

医学界研究的热点之一。现已证实，在缺血一再灌注

损伤、创伤感染、全身炎症反应(sirs)、多脏器功能

障碍综合征(mods)、退行性变以及中毒等中均存

在细胞凋亡的情况。目前，我国法医界已经开始利用

细胞凋亡理论和技术。进行法医毒理病理学方面的研究。f 卅

一、细胞凋亡

(一)细胞凋亡的概念

细胞凋亡又称程序性细胞死亡(pr0grammed cell

death pcd)，是在一定的生理或病理条件下，细胞按

照自身既定程序主动结束生命的一种死亡形式。是

由一些特殊信号刺激细胞内在固有的死亡程序所诱

发的细胞主动死亡现象。细胞凋亡是细胞衰老、死亡的正常生理过程，然而，许多致病因素也能导致凋

亡，被称之为病理性细胞凋亡。

(二)细胞凋亡与坏死的区别

坏死(necrosis)是细胞受到强烈理化或生物因

素作用引起细胞无序变化的死亡过程。首先膜的通

透性增加，细胞外形不规则变化，内质网扩张，核染

色质位移，细胞核和线粒体肿胀，溶酶体破坏，细胞

膜破裂，胞浆外溢，坏死的细胞被巨噬细胞吞噬，引

起周围组织不同程度的炎症反应。

凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。首先是染色质的凝集，嗜碱性染色增

强，细胞核崩解。线粒体保持形态正常。最后细胞收

缩变圆，胞体变小，染色质固缩，凝集至核膜周边，胞

浆浓缩，内质网扩张并与细胞膜融合，核仁裂解，细

胞皱缩，继之细胞内陷将细胞分割成大小不等的、多

个具有膜包囊的细胞凋亡小体fapoptotic micro—

body)。他们从细胞表面出芽脱落，并被吞噬细胞、上

皮细胞吞噬。由于此过程不发生溶酶体、线粒体及细

胞膜破裂，没有细胞内涵物外溢，故不引起炎症反应

和周围组织次级损伤。

(三)细胞凋亡的基因调控

细胞凋亡是一系列基因的激活、表达、调控的结

果。调控基因主要通过死亡受体途径(如fas／fasl

受体一配体系统)介导，引起caspases激活导致细胞

凋亡，这是大多数细胞凋亡的形式。有研究发现，有

些促凋亡基因如bax即使在caspases失活的情况

下仍可介导线粒体损伤，使线粒体膜通透性增加，释

放细胞色素c导致细胞凋亡。这表明线粒体是介导

细胞凋亡另一途径。另外。也可通过内质网途径发生

凋亡

[作者简介]张海东(1969一)，男，汉族，山东人，医学学士，副教授，副主任法医师，研究方向：法医病理学；

tel：+86—10—68633318。e—mail：zhd_ zzw@126．com

法律与医学杂志2007年第14卷(第3期)

调控基因包括促进细胞凋亡的基因和抑制细胞

凋亡的基因两大类阁。凋亡促进基因(apoptosis on)包

括野生型p53，ice，tgfb，fas，c—myc，ced一3，ced-

4。bax等。凋亡抑制基因(apoptosis of)包括bc1-2，rb．ced一9，突变型p53等。

二、细胞凋亡与中毒

(一)细胞凋亡的毒理学意义

细胞凋亡不仅是多细胞体的生命过程，也是机

体受外源物质侵害时的一种病理性防御反应。外源

化学物质作用于机体，其毒性呈现一定的剂量一效应

关系和时间一效应关系，而这种s形曲线同样出现在外源物质诱导凋亡的过程中。在一定剂量范围内，外

源化学物质作用于细胞并不直接杀死细胞，而只是

引起细胞损伤，使这些细胞获得了激活内在程序性

自杀机制的能力，最终导致细胞凋亡，且凋亡细胞数

与毒物的剂量和作用时间呈明显s形关系曲线。而

当毒物作用超过细胞负荷能力，它便会象机体发病

那样表现出“病态”一坏死，从而引发一系列的继发

损害。[6

1(二)细胞凋亡的毒理学研究

近年来。在一些中毒实验研究中已发现存在细

胞凋亡的现象。韦献良等同研究发现海洛因成瘾大

白鼠脑组织广泛出现神经元凋亡。并认为这是海洛

因成瘾致脑细胞神经元死亡的主要形式。

saleh等

[81在低剂量对氧磷中毒鼠模型中发现

有典型细胞凋亡的特征。田英平等[9在大鼠急性甲

胺磷中毒的模型研究中发现存在膈肌细胞凋亡，由

此，推测膈肌细胞凋亡可能是急性有机磷中毒、呼吸

肌麻痹发生和呼吸肌功能不全的原因之一。王英鹏

等㈣对有机磷中毒后的动物迟发性神经病变中细

胞凋亡的变化进行了研究，发现在母鸡三磷酸甲酯

中毒模型中出现腰髓前角神经元细胞凋亡现象。说

明通过凋亡引起神经元功能损伤在有机磷中毒后迟

发性神经病中起重要作用。曾明等[11对乐果对小鼠

骨骼肌的细胞毒性和凋亡诱导效应进行研究，发现

乐果对离体骨骼肌细胞具有明显的细胞毒性。并诱

导骨骼肌细胞的凋亡，可能在有机磷农药中毒中间

型综合征(ims)的发病过程中发生作用。

井玲等[ 21报道，在氟化钠中毒大鼠中，氟化钠

致肝细胞凋亡，且在氟中毒肝脏病变中扮演重要角

色。呼亚伟等[ 31研究发现氟中毒可导致肝、肾细胞

凋亡，p53参与并介导细胞凋亡。邢德利等㈣研究认

为，过量氟致大鼠脑细胞增殖能力下降和细胞凋亡

· 233 ·

增高。与氟神经毒性作用机制有关。

piantadosi等旧在大鼠一氧化碳(co1中毒研究

中发现。co中毒后鼠大脑内既有脑细胞坏死，又有

脑细胞凋亡的现象。刘菲等[ 61在其实验研究中得

出。co中毒致大鼠脑细胞凋亡，可能是co中毒致

脑损伤的病理机制之一。刘颖菊等旧研究发现急性

co中毒可引起小鼠大脑皮层、海马、纹状体等部位

脑细胞凋亡，凋亡细胞在3天后明显增加，5～7天达

到高峰，14天后恢复正常，同时可诱导促凋亡基因

fas、fasl蛋白表达，表达高峰在中毒后3～2天，早

于凋亡发生的时间。认为中毒所致迟发性脑病可能

与脑细胞凋亡有关。刘福佳等[18通过观察co中毒

后小鼠海马细胞凋亡和凋亡相关因子bcl一

2、bax和

caspasa一3蛋白表达变化。进一步探讨了co中毒迟

发性脑病的发生机制。

朱万琴等[ 91在大鼠醋氨酚中毒研究中报道。醋

氨酚所致肝细胞凋亡，随中毒剂量增大，肝细胞凋亡

数增多。同时伴大量肝细胞坏死。认为肝细胞凋亡过

度同样是肝细胞损伤的一种方式，可能是肝细胞坏

死的主要机制。

dusinska m 等研究发现。百枯草中毒后大量

超氧阴离子自由基的产生导致强烈外源性氧化应激

反应。直接引起肺组织细胞dna的损伤而致细胞

凋亡明显增加。另外，杨俊慧等[21发现在卡那霉素

耳中毒后耳蜗毛细胞存在凋亡。在耳蜗损害中起重

要作用。

(三)细胞凋亡的法医毒理病理学研究

程亦斌等[ 通过建立小鼠毒鼠强中毒的实验模

型。通过常规h-e染色及凋亡细胞检测技术对小鼠

毒鼠强急、慢性中毒后脑、心、肝、肾等器官的病理学

改变进行系统研究分析，发现急性大剂量毒鼠强中

毒后，在组织细胞尚未来得及大量发生凋亡的前提

下，机体已因阵发性或持续性痉挛抽搐而死亡，但其

发生凋亡的细胞数仍较正常对照组为多，只尚未达

到高峰。慢性中毒组小鼠在中毒后的不同时间段内，脑、心、肝、肾等器官凋亡细胞数均高于正常对照组

及急性中毒致死组，且同一器官的凋亡细胞数在不

同中毒时间段内有所差异；不同器官的凋亡细胞数的峰值在不同中毒时间段内亦有所不同。认为慢性

毒鼠强中毒，在临床症状不明显及法医毒物分析难

以检测的情况下，应用凋亡细胞检测技术可成功检

测出机体的主要器官的病理学改变，表明小剂量、慢

性中毒对机体仍有一定的影响。

· 234 ·

以后，雷怀成等 分别对乌头碱中毒的心肌细

胞、肝细胞和肾小管上皮细胞凋亡的观察。发现大鼠

在中毒后的不同时间段，心肌细胞、肝细胞和肾小管

上皮细胞凋亡数均高于正常对照组，且同一器官的凋亡细胞数在不同时间段差异有显著性。提示在乌

头碱中毒临床症状不明显及毒物分析难以检测的情

况下．应用凋亡细胞检测技术可成功检测出心肌细

胞、肝细胞和肾小管上皮细胞的病理学变化。

三、结语

许多资料表明．外源性化学物质可以诱导或抑

制细胞凋亡，凋亡又与细胞生物学、免疫学等多种重

要的生物学科和医学学科相关联。我国法医毒理学

具有鲜明的特色旧，有许多毒物的中毒机制等方面

仍需进一步探讨。上述法医学研究结果为毒理学、法

医毒理病理学及临床医学提供了较为系统的资料，为今后其他类似毒物的法医毒理病理学研究提供了

新方法和实验依据。

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(收稿：2006—11-14)

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细胞凋亡总结 细胞凋亡分析篇2

细胞凋亡 凋亡（apoptosis）一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。

1．细胞凋亡的意义 细胞凋亡普遍存在于生物界，既发生于生理状态下，也发生于病理状态下。由于细胞凋亡对胚胎发育及形态发生（morphogenesis）、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用，并具有潜在的治疗意义，至今仍是生物医学研究的热点。细胞凋亡过多可引起疾病发生，如：①爱滋病的发展过程中，cd4+t细胞数目的减少；②移植排斥反应中，细胞毒性t细胞介导的细胞死亡；③缺血及再灌注损伤，导致心肌细胞和神经细胞的凋亡增多；④神经系统退化性疾病（alzheimer病、parkinson's病）的重要原因是细胞凋亡的异常增加。神经细胞的凋亡参与老化及alzheimer病的发生。alzheimer氏病是一种常见的老年病，患者在临床上表现为进行性的智力减退。⑤暴露于电离辐射可引起多种组织细胞的凋亡。细胞凋亡过少也可引起疾病发生：在肿瘤的发生过程中，诱导凋亡的基因如p53等失活、突变，而抑制凋亡的基因如bcl-2等过度表达，都会引起细胞凋亡显著减少，在肿瘤发病学中具有重要意义；针对自身抗原的淋巴细胞的凋亡障碍可导致自身免疫性疾病；某些病毒能抑制其感染细胞的凋亡而使病毒存活。

2．细胞凋亡的形态变化 电镜下细胞凋亡的形态学变化是多阶段的，可分为 ①细胞浆浓缩，核糖体、线粒体等聚集，细胞体积缩小，结构更加紧密； ②染色质逐渐凝聚成新月状附于核膜周边，嗜碱性增强。细胞核固缩呈均一的致密物，进而断裂为大小不一的片段：

③胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的由胞膜包裹的凋亡小体(apoptotic bodies)。凋亡小体内可含细胞浆、细胞器和核碎片，有的不含核碎片；④凋亡小体被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解： ⑤凋亡发生过程中，细胞膜保持完整，细胞内容物不释放出来，所以不引起炎症反应。左图 典型凋亡小体：染色质呈新月状，并可见细胞器 右图 凋亡细胞：凋亡细胞(↑)与邻近细胞分离 细胞凋亡 光镜下凋亡一般累及单个或少数几个细胞，凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞核染色质聚集成团块状。由于凋亡细胞迅速被吞噬，又无炎症反应，因此，在常规切片检查时，一般不易发现，但在某些组织如反应性增生的次级淋巴滤泡生发中心则易见到。病毒性肝炎时，嗜酸性小体形成即是细胞凋亡。

3．细胞凋亡的机制 细胞凋亡是一系列依赖能量的分子水平变化的终点，细胞凋亡过程包括以下4个阶段，即：诱导启动、细胞内调控、实施和凋亡细胞的吞噬搬运阶段。

（1）诱导启动 引起凋亡的信号可以来自细胞外，通过跨膜传导对细胞内的调控分子起作用；也可以直接作用于细胞内的靶分子。一些跨膜作用的抑制因子(如生长因子、某些激素、细胞因子、某些病毒蛋白等)具有抑制凋亡的作用，有利于细胞的生存。当这些因子缺乏时，会激发细胞凋亡。另外一些跨膜作用的刺激因子通过受体与配体的结合而激活细胞凋亡程序，其中最重要的是肿瘤坏死因子受体家族。此外，尚有多种其它凋亡诱导因子。在胚胎发育过程中，形态发生蛋白、生长因子、分化因子对细胞凋亡可起促进作用，又可起抑制作用。

（2）细胞内调控 细胞内的某些特异蛋白与细胞死亡信号相连接，这些特异蛋白对细胞的死亡与否起决定作用。bcl-2蛋白家族(bcl-2 family of proteins)是调节线粒体通透性的主要成分，通过形成同源(bcl-2/bcl-2, bax/bax)和异源(bcl-2/bax)二聚体对细胞凋亡进行调控。bcl-2同源二聚体抑制细胞凋亡，bax同源二聚体促进细胞凋亡。此外，细胞表面受体fas(cd95)，属tnfr家族，当免疫细胞产生的fas的配体与t细胞表面的fas结合时，也启动了死亡程序。这种fas-fas配体介导的凋亡在清除免疫反应(如自身免疫病)中被激活的淋巴细胞非常重要。细胞凋亡后的梯状dna 足叶乙甙诱导白血病细胞凋亡后的梯状dna

（3）凋亡的实施 细胞凋亡的实施是通过蛋白水解的一系列连锁反应实现的。各种组织的细胞凋亡都要激活caspase家族。caspase成员作为酶原的形式存在于细胞内，经裂解激活后，迅速启动序列性酶解死亡程序，裂解细胞骨架和细胞核蛋白基质并激活了核酸内切酶。在内源性核酸内切酶作用下，dna进行有控降解，产生长度为180～200 bp整倍数的dna片段，这正好是缠绕组蛋白多聚体的长度，提示染色质dna恰好是在核小体与核小体连接部被切断。dna琼脂糖凝胶电泳出现ladder也成为检测凋亡发生的重要标志。

（4）凋亡细胞的吞噬搬运 凋亡细胞碎片的表面有标志分子(血小板反应素、粘附糖蛋白)有利于临近的巨噬细胞以及其他细胞的识别、吞噬和处理。凋亡细胞的吞噬搬运过程非常有效而迅速，凋亡细胞很快消失，不留痕迹，也无炎症反应。

4．细胞凋亡与坏死的区别 凋亡 坏死

1机制 基因调控的程序化（programmed）细胞死亡，主动进行（自杀性）意外事故性（accident）细胞死亡，被动进行（他杀性）

2诱因 生理性或轻微病理性刺激因子诱导发生，如生长因子缺乏 病理性刺激因子诱导发生，如缺氧、感染、中毒 死亡范围 多为散在的单个细胞 多为聚集的大片细胞

3形态特征 细胞固缩，核染色质边集，细胞膜及各细胞器膜完整，膜可发泡成芽，形成凋亡小体 细胞肿胀，核染色质絮状或边集，细胞膜及各细胞器膜溶解破坏，溶酶体酶释放，细胞自溶

4生化特征 耗能的主动过程，有新蛋白合成，dna早期规律降解为180-200bp片段，琼脂凝胶电泳呈特征性梯带状 不耗能的被动过程，无新蛋白合成，dna降解不规律，片段大小不一，琼脂凝胶电泳不呈梯带状

5周围反应 不引起周围组织炎症反应和修复再生，但凋亡小体可被邻近细胞吞噬 引起周围组织炎症反应和修复再生

细胞自噬

细胞自噬的生理功能

1及时清除细胞中随时产生的“垃圾”（如破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、合成错误或折叠错误的蛋白质等），2维持细胞自稳状态.无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的

3.同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质，又可为细胞提供一定的能量和合成底物.可以说，细胞自噬就是一个“备用仓库”.鉴于上述作用，在正常生理情况下，细胞自噬可以帮助细胞在缺乏营养的恶劣环境中生存.自噬也可为肿瘤细胞带来几大好处：

（1）首先，肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机

（2）（2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损dna赢得时间和条件.(3)另外，抑制细胞自噬可以导致细胞更容易发生凋亡，然而，细胞自噬在肿瘤的生成和癌症的发展中到底扮演怎样的角色，目前还没有取得广泛一致的意见.细胞自噬可以抑制细胞发生癌变，可能产生于以下几种机制

(1)细胞自噬的抑制会加重坏死细胞的局部炎症反应，从而导致肿瘤的生长(2)而细胞自噬可以清除坏死的细胞器，调整内源性的压力，从而稳定基因组,减少细胞向癌细胞的转变.(3)细胞自噬既可以加强细胞检验点的检查作用，又起到了稳定基因组的作用，从而减少了细胞的癌变

细胞凋亡总结 细胞凋亡分析篇3

课程报告

都在说二十一世纪是生命科学的世纪，很荣幸能够进入生物科学这个行业。

关于对自己所学专业，可能最初是兴趣让我来到这个专业，不是太清楚为什么会对这个专业有这么大的热情，但真的很喜欢它。生物技术，最官方的定义是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。生物技术是人们利用微生物、动植物体对物质原料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。它主要包括发酵技术和现代生物技术。现代生物技术综合基因工程、分子生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、胚胎学、免疫学、有机化学、无机化学、物理化学、物理学、信息学及计算机科学等多学科技术，可用于研究生命活动的规律和提供产品为社会服务等。

再我自己看来生物技术其实是一个既可以看做一个基础学科也可以看做是一个很新兴的，综合性的学科。其实生物技术这是一个很综合性的学科，现在和很多领域接轨，对我们而言这是机遇和挑战。

对我自己而言，我想在生物技术这方面有所建树，最主要的还是在科研方面能攻克一些难题，虽然可能现在想法不是太成熟但是我相信经过几年的磨练与努力我能够攻破这些难题。希望能够在大一下就能够进入实验室，学一些基础的实验技能为以后自己做项目打下基础。

然后关于自己的专业，现在我们所学的知识其实普遍落后，教科书的编排更新不及时，可能我们学到的东西可能学校外面已经开始产业化了，测序技术已经开始第四代了，而我们可能毕业前一年才开始学习切片制作，学习的东西很古老，再就是我们这个专业，并没有像其他几大理科领域一样有清晰的逻辑和量化，这导致了很多小领域只有开头和结果而没有一个可复制的过程，而没有可复制的过程就代表着无法带领这个行业产业化，因此，这个行业在没有开源的情况下就无法支撑这个领域下的大多数学生的温饱，就只能节流，这样就导致了本专业的人才无法继续从事与本专业有关行业，转而从事其他行业，从而导致人才流失，最终专业发展缓慢。而谈到生物技术不得不说到它和其他行业接轨这一问题，的确，和其他领域接轨形成交叉学科是一个理想的出路，如合成生物学，生物信息学，的确给生物注入了一股生机。但是我们都知道越巨大的事物迈步子很大也很缓慢，何况在人才流失的情况下。

说到这里，可能真的学习这个专业我们更多的是在学习了基础课程后，自己学习最新更新的知识，在老师的指导下自己收集资料自己进行实验，再完成项目。

很多人对生物技术这个专业有很多的误解，我们在完成自己研究项目的同时也有义务科普大众。毕竟这也是吸引人才的重要途径，同时也是解决本专业人才流失的好方法。

我自己有一个不成熟的想法，很久之前曾了解到俄罗斯的“永生计划”它的设计活体意识转移到机器人身上，对此几乎大多数人是不看好，不支持的。而对于这个“永生计划” 我有一个想法，癌细胞是无限增殖，如果我们能够完全弄清楚癌细胞的增殖过程及机理，并能够运用到人体衰老细胞中，对衰老细胞进行基因修饰添加经过改良的癌细胞中能够无限增殖的基因，或许“永生”并非不可能。同样的癌细胞的无限增殖基因或许也能在器官移植这一领域有所贡献，也是利用无限增殖，让器官细胞增殖，成长成完整的细胞。或许研究出癌细胞无限增殖的机理并提取其这个基因对人类会有很大贡献。

至于疑惑这个方面就是在教材更新换代不及时的情况下，我们是否只能通过课外阅读这些方式来扩展自己的知识面，还有就是技术的更新我们是否能够跟的上，倘若有同学本科毕业便想进入行业工作，最新的技术他们又要从何学习。最后关于实验室，毕竟如果想要真的从事生物研究该如何合理利用现有资源来完成自己的项目。

最后我个人的话最想获得的是关于癌细胞无限增殖机理方面的指导，和我不成熟构想的可实施率。

以上是我个人对本专业的认识及理解，以及对未来设想。

谢谢老师阅读，有不正确的地方请老师批评指正。

细胞凋亡总结 细胞凋亡分析篇4

细胞凋亡实验技术总结 一形态学检测

1、光学显微镜和倒置显微镜观察法

未染色细胞:凋亡细胞体积变小、变形，膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩，变圆，脱落。染色细胞:姬姆萨染色，瑞氏染色等。凋亡细胞染色质浓缩，边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状，形成凋亡小体。

2、荧光显微镜检测法-荧光染料

例如，碘化丙啶(pi)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，pi 能够透过细胞膜而使细胞核红染。选用536nm 激发光，细胞核呈红色荧光。

3、电子显微镜

收集细胞，%戊二醛4°c 固定24h，1%四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，经包埋剂浸透后环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。凋亡ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

4、激光扫描共焦显微镜技术

fitc-annexinv+pi双染，观察凋亡过程中细胞膜ps表面的变化，并区分正常细胞(an-pi-)，早期凋亡细胞(an+pi-)，晚期凋亡细胞及坏死细胞(an+pi+)，细胞收集过程中出现的损伤细胞(an-pi+)。

二、细胞凋亡的生化及分子生物学检测

1、dna 断裂检测法

如使用琼脂糖凝胶电泳检测，细胞凋亡时，核染色质凝聚，染色质dna 在核小体单位之间的连接处断裂。凋亡早期可形成50~300kbp 的dna 大片段，晚期核酸内切酶在核小体之间剪切核dna，产生大量长度在180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段。

2、膜联蛋白v 法

磷脂酰丝氨酸(ps)位于正常细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，ps 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜表面。annexin-ⅴ(膜联蛋白-v)是一种分子量为35-36kd 的ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，与ps高亲和力。将annexin-ⅴ进行荧光素或生物素标记，以标记了的annexin-ⅴ作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。

3、细胞凋亡的酶caspase检测

检测caspase活力可用免疫杂交技术分析酶原的加工和底物水解的产物，或用人工底物检测酶活力，也可对活化的caspase做亲和标记。例如分析底物的水解产物，parp(多聚adp-核糖聚合酶)第一个被认识的caspase-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000 及相对分子质量为25000 的两个片段，用抗相对分子质量为85000 片段的抗体检测细胞是否发生凋亡。

4、线粒体膜势能变化的检测

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱反映了线粒体内膜电负性的增高或降低流式细胞仪检测细胞的荧光强度或荧光显微镜观察，拍照正常细胞中, rh123 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失。而凋亡时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位的崩溃, rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光。

细胞凋亡总结 细胞凋亡分析篇5

磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, ps）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，ps可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。annexin-v是一种分子量为35~36kd的ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与ps高亲和力特异性结合。将annexin-v进行荧光素（fitc、pe）或biotin标记，以标记了的annexin-v作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

ps转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

碘化丙啶(propidine iodide, pi)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，pi能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将annexin-v与pi匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（fitc-/pi-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（fitc+/pi+）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（fitc+/pi-）。右上象限为独立的核（fitc-/pi+）。

annexin-v可以再钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。

pi是一种dna染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，pi从而进入细胞核与dna结合。

所以

annexin-v阴性-pi阴性 代表正常细胞

annexin-v阳性-pi阴性 代表凋亡早期的细胞

annexin-v阳性-pi阳性 代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞

annexin-v阴性-pi阳性 一般不存在这一群细胞，如果出现这一团细胞可能是pi标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。（还有一种说法是凋亡最后阶段的细胞，细胞已经没有细胞膜了说以不结合annexin-v而只结合pi）

2.线粒体膜电位变化的检测

实验原理

jc-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△ψm的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，jc-1 聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(j-aggregates)，可以产生红色荧光（fl-2 通道）；在线粒体膜电位较低时，jc-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时jc-1 为单体(monomer)，可以产生绿色荧光（fl-1 通道）。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过 jc-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用jc-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

jc-1 单体的最大激发波长为 514nm，最大发射波长为 527nm；jc-1 聚合物(j-aggregates)的最大激发波长为 585nm，最大发射波长为 590nm。

a-c 为对照，细胞亚群(r1)在 fl-2和fl-1 通道同时显示 jc-1 的荧光信号。d-f 显示 jc-1在fl-2通道荧光信号降低的细胞亚群(r2)显著增加，证明线粒体膜电位△ψm 下降，细胞发生凋亡。凋亡与线粒体膜电位的去极化相关。细胞凋亡时线粒体膜电位发生去极化，jc-1进入线粒体以单体形式存在，仅在fl-1通道有荧光。

检测原理

正常细胞：jc-1聚集在线粒体内，形成多聚体，呈鲜红色荧光，细胞质内有绿色；即红光++，绿光++。

凋亡细胞：由于线粒体跨膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，红色荧光减弱，单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。即红光+，绿光++

3、caspase-3活性的检测

caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。caspase-3正常以酶原（32kd）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的caspase-3由两个大亚基（17kd）和两个小亚基（12kd）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

(1)western blot 分析procaspase-3的活化，以及活化的caspase-3及对底物多聚adp-核糖聚合酶[poly（adp-ribose）polymerase，parp]等的裂解。

(2)荧光分光光度计分析

检测原理：活化的caspsae与其特异性底物devd-pna结合切割，释放出游离pna，通过测定其吸光度，根据其发光强度的高低代表其活化程度。

(3)流式细胞术分析

pharmingen 多克隆或单克隆 caspase-3 抗体可以识别 caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的 pro-caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端, 荧光标记多克隆兔抗 active-caspase-3 抗体为流式细胞术分析凋亡细胞的 caspase-3 而设计。1、2、3是早期凋亡现象；

4、5是晚期凋亡现象。

4、tunel法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp缺口末端标记)

细胞凋亡中, 染色体dna双链断裂或单链断裂而产生大量粘性3'-oh末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（tdt）的作用下将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到dna的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, tunel）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有dna的断裂，因而没有3'-oh形成，很少能够被染色。tunel实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

5、dna ladder 细胞凋亡晚期，核酸内切酶在核小体之间剪切核dna，产生大量长度在180-200 bp 的dna片段。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯dna，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的dna ladder。在琼脂糖凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(dna ladder)。坏死细胞---连续性条带。

一、形态学观察方法

1、he染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。苏木精 — 伊红染色法，(hematoxylin-eosin staining)，简称he染色法。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

2、丫啶橙（ao）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

一、细胞凋亡的形态学检测

1、光学显微镜和倒置显微镜

（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的dna特异性染料有：ho 33342(hoechst 33342)，ho 33258(hoechst 33258), dapi。三种染料与 dna的结合是非嵌入式的，主要结合在dna的a-t碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

hoechst是与dna特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用pbs稀释成终浓度为2~5mg/ml。

dapi为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为 ~1mg/ml。

结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。

3、透射电子显微镜观察

结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。图2

七、凋亡相关蛋白tfar19蛋白的表达和细胞定位分析

tfar19（pdcd5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（fitc）标记的tfar19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中tfar19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期tfar19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期tfar19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（ps）外翻和细胞核dna的片段化，提示tfar19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期tfar19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现tfar19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。